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零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)上海翊圣生物科技有限公司

银牌供应商

性能参数

产品名称: 零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)
英文名称: Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit
产品货号: 10910ES20
产品规格: 20T
产品产地: Yeasen
产品商标: Yeasen
价    格: 625.00元
保存与运输: 冰袋运输。-20°C保存,避免反复冻融。
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/10/20 18:25:00
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诚信指数:896点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海翊圣生物科技有限公司
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200030
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产品详细描述

产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit

零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)

10910ES20

20T

-20

625.00

产品描述

本试剂盒是利用拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成,与传统的T4连接酶相比,具有以下优势:1)快速,仅需1-5分钟即可完成连接反应。2)高效,无自连现象,阳性克隆?#24335;?#36817;100%,无需设置蓝白斑筛选;3)操作简单,从连接到涂板仅需15-20min。操作过程省去冰浴、热激和1h复苏。4)可连接长达10kb目的产物;5Hieff CloneTM Topo-blunt simple vector不含多克隆酶切位点(MCS),使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作?#20445;?#19981;会受到MCS位点的影响,从而增加酶切效率以及克隆成功率。

产品用途

平端PCR产物的克隆。

克隆后PCR产物的快速测序【使用M13F/M13R引物】。

产品组分

组分编号

组?#32622;?#31216;

产品货号(规格)

10910ES2020T

10910ES605×20T

10910-A

pESI-Blunt simple vector (30ng/μl)

20μl

20μl

10910-B

1kb control insert (40ng/μl)

5μl

5×5μl

10910-C

10×Enhancer

20μl

5×20μl

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存,避免反复冻融。有效期一年。

注意事项

1pESI-Blunt simple vector (30ng/ul) 插入位点两端不含多克隆酶切位点,需要在PCR设计引物时引入合适酶切位点。

2)为了您的安全和健?#25285;?#35831;穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

 Control DNA 片段的克隆实验

1)在无菌微量离心管中配制下列DNA溶?#28023;?#20197;10μl为例。

1kb control insert (40ng/μl)

1μl

10  Enhancer

1μl

pESI-Blunt simple vector (30ng/ul)

1μl

ddH2O

7μl

2)混匀上述体系。于室温(20-30)反应5min

【注】:连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min,一般1-2min即可完成连接反应,得到足够的重组子。

3)连接产物可直接转化或于-20保存。

4全量10ml加入100ml感受态细胞,轻轻混匀,室?#36335;?#32622;5min

【注1】:也可取5ml连接?#28023;?#21152;入50ml感受态细胞中(加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)

【注2】:通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室?#36335;?#32622;5min便可获得足够多转化子,如果感受态细胞效?#24335;系褪保?#21487;以按照冰浴热激的标准程序进行。

5)加300-500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)37180 rpm振荡培养10min

6 200ml菌?#21644;?#26495;(含?#36991;?#25239;性的LBSOC固体培养基),培养过夜(如果预计转化?#30001;伲?#20026;得到较多克隆,4000 rpm 离心1min,吸弃掉部分上清,保留100ml,轻弹悬浮菌体,取全部菌?#21644;?#26495;)。

 一般DNA片段的克隆实验

所插入片段为平末端产物,利?#37238;?#20445;真酶(如Pfu酶)扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

【注】:aPCR产物不能***酸化。

       b、如扩增模板为质粒,模板质粒会在后续实验中引起假阳性,因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1)按照下表配制连接体系(以10μl为例*

10  Enhancer

1μl

pESI-Blunt simple vector (30ng/ul)

1μl

插入片段**

0.5-8μl

ddH2O

To 10μl

【注】:可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

** 不同的插入片段所用量参考下表

插入片段大小(1kb

最佳用量(ng)

0.1-1kb

20-50 ng

1-2kb

50-100 ng

2-5kb

100-200 ng

2)混匀上述体系。于室温(20-30)反应5min

【注】:连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min,一般1-2min即可完成连接反应,得到足够的重组子。

3)全量10ml加入100ml感受态细胞,轻轻混匀,室?#36335;?#32622;5min

【注1】:也可取5ml连接?#28023;?#21152;入50ml感受态细胞中(加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)

【注2】:通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室?#36335;?#32622;5min便可获得足够多转化子,如果感受态细胞效?#24335;系褪保?#21487;以按照冰浴热激的标准程序进行。

4)加300-500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)37 180 rpm振荡培养10min

【注】:通常商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下,10min复苏可以得到足够多转化子,如果感受态效?#23454;?#25110;者插入片段长转化?#30001;?#30340;情况下可以提高复苏时间到30-60min以得到更多的转化子。

5 200ml菌?#21644;?#26495;(含?#36991;?#25239;性的LBSOC固体培养基),培养过夜(如果预计转化?#30001;伲?#20026;得到较多克隆,4000 rpm 离心1min,吸弃掉部分上清,保留100-150ml,轻弹悬浮菌体,取全部菌?#21644;?#26495;)。

6)转化子的筛选鉴定

 菌液PCR鉴定;

 质粒大小鉴定:挑取单克隆,抽提质粒后可根据质粒大小进行鉴定。

 酶切鉴定:根据克隆实验设计,选择合适的限制性内切酶进行鉴定。

 测序分析:可选测序引物序列如下

   M13FTGTAAAACGACGGCCAGT

   M13RCAGGAAACAGCTATGACC

【注】:本制品阳性率相当高,一般情况下,阳性克隆?#24335;?#36817;100%,只要是长出来的菌落正常(不是污染的杂菌,转化子数量也不算太少),基本就是阳性克隆,因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。

pESI-Blunt simple vector sequence

ORIGIN

        1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct

       61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc

      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct

      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag

      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctt cagtcctgat gcttgttatc

      301 gtattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaagtcga tgtcgcgtct gcctgaagtc

      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc

      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga

      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg

      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt

      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga

      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa

      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt

      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt

      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc

      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga

      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat

     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct

     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc

     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg

     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc

     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg

     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca

     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc

     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat

     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc

     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc

     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt

     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac

     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg

     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca

     1861 gagtt

//

【注】:黄底为多克隆酶切位点序列

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